H1-H5孔包含了5個看家基因（HK1-HK5），用于芯片數(shù)據(jù)的標準化。H6為基因組DNA參照（GDC），其中固定的引物能特異性的檢測非轉(zhuǎn)錄的基因組DNA重復片段，從而檢測樣品中是否存在DNA污染。H7到H9是三個重復的孔，均為反轉(zhuǎn)錄參照（RTC），用于檢測RT反應(yīng)的效率。H10到H12是陽性PCR參照（PPC），反映了PCR反應(yīng)的效率。這些孔中加入了人工合成的DNA序列和相應(yīng)的引物對。兩組重復的對照RTC和PPC也可以用于檢測芯片間和芯片內(nèi)的一致性。
預設(shè)計的信號通路特異性PCR芯片
96孔模式的RT2Profiler PCR芯片根據(jù)SuperArray的Pathway-Centric TM原理設(shè)計，將現(xiàn)有的重要信號通路研究進展與PCR芯片方法結(jié)合，是檢測信號通路提供*的研究工具。在設(shè)計PCR芯片時，Superarray公司綜合了文獻資料，數(shù)據(jù)庫信息，專家意見和用戶反饋，不斷根據(jù)客戶需要開發(fā)新產(chǎn)品，并使芯片中所包含的基因更完整，更。在目前的市場中，SuperArray所提供的信號通路范圍zui廣，并且有針對人，小鼠和大鼠的PCR 芯片產(chǎn)品（參見表1以及產(chǎn)品目錄）。在芯片設(shè)計中，還整合了預測資料和實驗結(jié)果，幫助研究者系統(tǒng)地有針對性的開展研究。這些預設(shè)計的PCR芯片，分類詳細，針對性強，使研究者無需自己一一挑選基因，節(jié)省大量時間和精力，實驗過程簡便快速，大大推進了生命科學研究進展。目前，預設(shè)計的PCR芯片涵蓋了細胞凋亡，炎癥反應(yīng)，信號傳導，癌癥以及其他疾病等廣泛的生物學通路和疾病。詳細的芯片列表請登陸公司查詢。
| 應(yīng)用范圍 | PCR芯片產(chǎn)品舉例 | 芯片所包含的部分基因 |
| 生物學途徑 | 人細胞凋亡 （Cat. No. APHS-012） | TNF 配體和受體 BCL2 家族成員 Caspases 死亡效應(yīng)功能域 ATM和p53信號通路 |
| 功能或者結(jié)構(gòu)相關(guān)基因 | 小鼠細胞因子 （Cat. No. APMM-021） | 干擾素和白介素 骨形態(tài)發(fā)生蛋白 腫瘤壞死因子 多種生長因子 |
| 信號傳導途徑 | 人NFKB信號通路 （Cat. No. APHS-025） | 細胞外配體和受體 NFκB和IκB 家族成員 激酶 轉(zhuǎn)錄因子 反應(yīng)基因 |
| 疾病相關(guān) | 人癌癥信號通路發(fā)現(xiàn)者 （Cat. No. APHS-033） | 細胞周期控制和DNA損傷修復 細胞凋亡和細胞衰老 細胞黏附 血管生成 浸潤和腫瘤轉(zhuǎn)移 |
表1 SuperArray 提供的PCR Array產(chǎn)品舉例
訂制的PCR芯片
如果現(xiàn)有的產(chǎn)品無法滿足研究者的特定需要，SuperArray還可以提供從設(shè)計到芯片生產(chǎn)的完整服務(wù)，為研究者提供使用先進的PCR芯片的便捷服務(wù)?？蛻粲喼菩酒?wù)為研究者提供以下便利：1）在使用表達譜基因組芯片后，對從基因組水平篩選出來的一組基因進行驗證；2）在現(xiàn)有產(chǎn)品的基礎(chǔ)上作適當調(diào)整以適應(yīng)特殊需要；3）*從頭設(shè)計，適用于在現(xiàn)有的預設(shè)計PCR芯片中尚未包括的某個信號通路或者一組基因。若研究基因數(shù)目少于84個，還可以將96孔PCR芯片進一步分成更小的形式，從而可以在一次PCR反應(yīng)中研究多個樣品?；蛘哌M行多次重復。
有了這些產(chǎn)品和服務(wù)，研究者在利用這項新技術(shù)時，可以專注于研究自己所感興趣的特定基因組合時，實驗中也更加省時省力。
PCR 芯片實驗體系
完整的PCR芯片實驗體系包括RT2ProfilerTM PCR芯片，RT2 Real-TimeTM SYBR Green PCR反應(yīng)體系和cDNA合成試劑盒。所有這些組分均為基于SYBR Green的實時定量PCR反應(yīng)優(yōu)化。精心設(shè)計的引物和優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系一起，為PCR芯片的特異性提供保證。在反應(yīng)體系中還加入了指示染料，用于檢測PCR反應(yīng)平臺的可靠性。
RT2 PCR引物和RT2 Real-TimeTM SYBR Green PCR反應(yīng)體系
采用PCR芯片開展研究，技術(shù)上的難點是如何在同一次實驗中，相同的PCR反應(yīng)條件下保證不同的基因有相近的擴增效率，并且獲得與單個基因?qū)崟r定量PCR反應(yīng)相當?shù)撵`敏度，特異性和可重復性。為此，SuperArray首先設(shè)計篩選出*的候選引物，接著通過實驗，在不同反應(yīng)條件下，檢測PCR反應(yīng)體系與幾千條PCR引物的組合，zui終獲得了優(yōu)化的引物和PCR反應(yīng)體系，適應(yīng)PCR芯片的要求。
RT2ProfilerTM PCR芯片引物的特點
通過計算機分析和實驗驗證，引物達到以下要求：
1.特異性：通過BLAST等比對方法，檢測確認引物在相應(yīng)物種（人，小鼠或大鼠）全基因組中的高度特異性，有效避免非特異性產(chǎn)物產(chǎn)生。并通過實驗證明引物不會擴增E.coli基因組，后者是Taq DNA多聚酶的常見污染源。
2.均一性：所使用的引物的CG含量，解鏈溫度（Tm），以及其他一些化學的和物理的特性都相似，以保證在相同的PCR條件（尤其是相同退火溫度）下，芯片中的不同的基因都能擴增出特異性產(chǎn)物。
3.擴增效率：引物擴增的片段大小均在100到200bp左右，確保在相同的反應(yīng)時間內(nèi)，不同的基因均能擴增出完整片段；并增強引物3’ 端的鉚定能力，減少引物二聚體和非特異性退火的發(fā)生。
RT2ProfilerTM PCR芯片PCR反應(yīng)體系的特點
在基于SYBR Green的實時定量PCR反應(yīng)中，PCR反應(yīng)體系也起到重要作用。嚴格控制的熱啟動Taq酶是一個關(guān)鍵因素。RT2 Real-TimeTM PCR反應(yīng)體系采用了一種*的，經(jīng)過化學修飾的熱啟動Taq酶，只有在熱激步驟之后，酶的活性才能*發(fā)揮。在嚴格控制反應(yīng)條件的情況下，在較低溫度下發(fā)生的非特異性引物結(jié)合無法進一步擴增。其他的反應(yīng)體系則常常將這些模板進一步擴增成為非特異性產(chǎn)物，造成假陽性結(jié)果。此外，Superarray還對RT2 Real-TimeTM PCR反應(yīng)體系中的化學組分進行優(yōu)化，進一步減少了引物二聚體的形成，并能保證zui難擴增的片段都得到*的擴增效率。PCR芯片結(jié)合了高質(zhì)量的PCR引物設(shè)計和RT2 Real-TimeTM PCR反應(yīng)體系，為PCR的高芯片質(zhì)量提供了保證。
表格2總結(jié)了RT2ProfilerTM PCR芯片的特點。
| 芯片設(shè)計 | 84個通路特異性基因 |
| 5個看家基因 |
| 1個基因組DNA參照 |
| 3個反轉(zhuǎn)錄參照（RTC） |
| 3個陽性PCR參照（PPC） |
| 引物設(shè)計 | 特異性：序列比對篩選 |
| 一致性：統(tǒng)一的熔解和退火溫度 |
| 反應(yīng)效率：短的擴增片段 |
| 反應(yīng)體系 | 熱啟動Taq酶： 避免引物二聚體等的產(chǎn)生 非特異性引物結(jié)合無法進一步擴增 |
| 反應(yīng)體系為SYBR green實時定量PCR優(yōu)化 |
表2 RT2ProfilerTM PCR芯片的特點
RT2ProfilerTM PCR芯片特點靈敏度
研究者總是希望能檢測到表達量相當?shù)偷幕?，有時候，研究者得到的起始總RNA量也很少，但仍希望能進行實時定量PCR檢測。為了滿足研究者的這些需要，Superarray嚴格檢測了PCR芯片系統(tǒng)的靈敏度。例如，Superarray使用PCR芯片檢測了一系列總RNA樣本，這些樣本的濃度都不相同，使用的PCR芯片為炎癥細胞因子和受體基因芯片，通常，這些基因的表達量都是很低的。圖3將陽性信號的比例（Ct<35的基因所占百分比）與相應(yīng)的總RNA量對應(yīng)起來作圖。結(jié)果表明，當起始的總RNA范圍在5.0ng到1.0ug（甚至是5.0ug）時，每張PCR芯片的陽性信號比率均超過85%。對于表達量更高的基因，芯片檢測的靈敏度還會大大提高，即在起始RNA量更低的情況下，芯片能夠檢測到的陽性信號比例更高。值得注意的是，起始的總RNA量不要低于0.5-1.0ug，否則會造成陽性信號損失。由于陽性信號比例在起始RNA量低時會顯著下降，所以在實驗中，檢測的zui低RNA量不少于5.0ng。
圖3 當總RNA量低至5.0ng時，使用RT2ProfilerTM PCR芯片實驗體系仍能獲得很高的陽性信號比例。
RNA樣品為XpressRefTM人總RNA（GA-004），起始RNA量分別為0.1，1.0，5，10，50，100和1000ng）。芯片為炎癥細胞因子和受體PCR芯片（APHS-011A）。采用RT2 Real-TimeTM SYBR Green / 熒光素PCR反應(yīng)體系（PA-011）。陽性信號的比例（Ct<35的基因所占的百分比）與對應(yīng)的總RNA量做圖。
特異性
PCR芯片體系的設(shè)計和優(yōu)化都是針對基于SYBR green的實時定量PCR反應(yīng)。由于SYBR Green與非特異的雙鏈DNA也會發(fā)生反應(yīng)，為了獲得高特異性，需要保證引物只擴增出特定的目的片段，從而使基于SYBR Green的PCR芯片能夠準確的檢測基因表達水平。Superarray通過實驗對設(shè)計合成的引物進行了驗證，保證引物擴增的產(chǎn)物是單一的，基因特異性的，沒有引物二聚體，也沒有非特異性擴增產(chǎn)物。
下面是一個檢測PCR芯片特異性的實驗。檢測PCR芯片中TGFβ和骨形成蛋白（BMP）家族各基因的熔解曲線，并且對PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳實驗，該家族的基因同源性很高。圖4顯示了BMP基因家族各基因擴增產(chǎn)物的熔解曲線和電泳結(jié)果。如圖所示，各熔解曲線均為單峰，電泳條帶亦單一，并且條帶大小與預期值一致。結(jié)果表明， PCR 芯片擴增出基因產(chǎn)物特異性高，即使相同RNA樣品中同一基因家族的同源基因也可以區(qū)別。優(yōu)化的體系在SYBR Green檢測中表現(xiàn)出高特異性，而這種特異性通常被認為只能在使用更加昂貴的基于探針的方法才能獲得。
圖4 PCR芯片的高特異性 RT2ProfilerTM PCR芯片對所檢測的基因顯示出高特異性
RNA樣品為XpressRefTM人總RNA（GA-004，5ug），PCR芯片為人TGFb/BMP信號通路PCR 芯片（APH-03），采用RT2 Real-TimeTM SYBR Green / 熒光素PCR反應(yīng)體系（PA-011）。通過標準熔解反應(yīng)步驟獲得熔解曲線（A），產(chǎn)物進一步通過瓊脂糖凝膠電泳檢測（B）。
重復性
實時定量PCR的定量特性使得PCR芯片的重復性強。為檢測重復性，2位研究者采用了同樣的總RNA樣品，分別進行了4次重復試驗。兩個人使用同種PCR芯片，但批號不同，并且每個人都分兩天進行試驗。比較兩位研究者分別做的4張芯片的原始Ct值。圖5顯示了比較結(jié)果的圖示和相關(guān)系數(shù)。每一組比較結(jié)果均獲得理想的曲線，斜率為1.0，相關(guān)系數(shù)均不小于0.99。結(jié)果顯示，PCR芯片實驗體系的重復性高，不同批次的芯片，不同時間進行實驗，不同的重復設(shè)計，在原始值水平都能獲得很高的重復性。
圖5 PCR芯片的重復性 PCR芯片具有高重復性
RNA樣品為XpressRefTM人總RNA（GA-004，5.0ug），PCR芯片為人藥物代謝PCR 芯片（APH-022A），采用RT2 Real-TimeTM SYBR Green / 熒光素PCR反應(yīng)體系（PA-011）。兩位不同的研究者分別進行了4次重復。A圖比較了原始的Ct值。B的表格則說明A中每組比較獲得的曲線的相關(guān)系數(shù)。
由于PCR芯片在技術(shù)上具備很高的重復性，在確保RNA樣品制備良好，PCR芯片實驗操作正確的情況下，所觀察到的基因表達水平的差異都是所研究的樣本本身的生物學特征所引起的，而不是由于實驗技術(shù)所造成的差異。表3總結(jié)了RT2ProfilerTM PCR芯片的特點。
| 靈敏度高 | 在僅用5ng總RNA時，可獲得85%的陽性信號 |
| 線性范圍廣 | 至少10的5次方 |
| 特異性強 | 引物擴增出單一的，靶基因特異的產(chǎn)物 |
| 重復性佳 | 同一實驗室重復實驗，比較原始Ct值的相關(guān)系數(shù)（R）≥0.99 不同實驗室重復實驗，比較基因表達倍數(shù)的相關(guān)系數(shù)（R）≥0.97 Ct的平均標準差為0.25 |
表3 RT2ProfilerTM PCR芯片的特點
總結(jié)：
RT2Profiler PCR芯片是研究一組特異性基因表達水平的理想方法?；赟YBR green 的實時定量PCR方法，適用面廣，簡單方便，使PCR芯片具有廣泛的應(yīng)用前景。選擇合適的芯片模式和相應(yīng)的反應(yīng)體系，即可開展PCR芯片實驗。芯片包括預設(shè)計的通路特異性PCR芯片或者客戶訂制PCR芯片。PCR芯片具有與實時定量PCR相當?shù)撵`敏度，特異性和重復性。PCR芯片的設(shè)計思路，使實驗設(shè)計和實際完成實驗的時間大大縮短，對結(jié)果的分析也更直接有效。使用PCR芯片，每張芯片使用的總RNA樣品量zui少可低至0.5ng，zui多則可達到5.0ug。PCR芯片的特異性保證擴增產(chǎn)物的*性和基因特異性。因此，檢測得到的基因表達水平差異真實的反映了所要研究的基因的情況。PCR芯片的重復性（intra-lab的相關(guān)系數(shù)為0.99）保證實驗結(jié)果是可重復的。RT2Profiler PCR芯片結(jié)合了實時定量PCR的優(yōu)點和芯片的高通量，是研究者開展研究的得力工具。
