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登革熱IgM ELISA試劑盒說明書（捕獲法）

登革熱IgM ELISA試劑盒說明書（捕獲法）

（美國Inbios進(jìn)口原裝：DDMS-1）

美國Inbios中國*代理商“深圳科潤達(dá)生物工程有限公司”竭誠為您服務(wù)

應(yīng)用范圍

DENV Detect IgM Capture ELISA是一種用來檢測人是否感染登革熱病毒的ELISA檢測系統(tǒng)，它可以檢測出人血清中是否存在抗登革熱病毒源性重組抗原（DENVRA）的IgM抗體。此診斷實(shí)驗(yàn)用于有登革熱發(fā)熱或是登革熱血熱臨床癥狀的病人檢測。陽性結(jié)果必須經(jīng)過蝕斑減少中和試驗(yàn)（PRNT）或是根據(jù)CDC疾病診斷指南確證。

用于臍帶血檢測，新生兒測試，產(chǎn)前篩查，或是普通人群篩查的實(shí)驗(yàn)特征性能還未建立。此試驗(yàn)未經(jīng)FDA明確證明可用于血液或血漿捐獻(xiàn)者的檢測。

注意：試驗(yàn)中需觀察西尼羅河或是其他病毒中的IgM是否會與登革熱試劑盒發(fā)生交叉反應(yīng)，如可能發(fā)生了交叉反應(yīng)，則視為警告狀態(tài)

前言說明

登革熱是一種急性病毒性疾病，它主要通過埃及伊蚊傳播。登革熱在臨床上主要表現(xiàn)為：雙相熱、皮疹和造血抑制，還可表現(xiàn)出全身癥狀，如全身不適、關(guān)節(jié)痛、肌肉疼痛和頭痛，有時(shí)還可能出現(xiàn)極為罕見的出血性高燒，并可能導(dǎo)致致命性的休克。登革熱主要流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)，大概每年會發(fā)生100,000,000 例。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年大概會出現(xiàn)500到1000萬例登革熱病人，同時(shí)還會出現(xiàn)250000到500000例登革熱出血熱。在2002年，據(jù)報(bào)道，30多個(gè)拉丁美洲的國家出現(xiàn)10000000例登革熱病人，并且大多數(shù)是登革熱出血熱（DHF）病人。之后在2003年到2005年，在印度的一些地方也廣泛流行 DHF。在美國，據(jù)報(bào)道，DHF病人在1996到2002年就增加了三倍。據(jù)報(bào)道說，登革熱也在夏威夷和德克薩斯州的拉雷多爆發(fā)過。由于病毒的潛在傳染性，一些病毒包括登革熱都被列為CDD的A類潛在傳染源。Inbios公司的登革熱IgM抗體捕獲法ELISA試劑盒很適合于CDC中使用，在感染后3到 5內(nèi)，原發(fā)性和繼發(fā)性病人的體內(nèi)都有可檢測到的IgM抗體水平，而且這種抗體通?？梢栽谌梭w內(nèi)持續(xù)90天。

實(shí)驗(yàn)原理

DENV Detect IgM ELISA試劑盒是由一種酶聯(lián)擴(kuò)大的兩步法免疫檢測系統(tǒng)。在此實(shí)驗(yàn)中，將登革熱陰性質(zhì)控、陽性質(zhì)控和未知濃度的血清樣品用樣品稀釋液稀釋，然后加入到包被了抗人IgM抗體的微孔中溫育，之后分別加入登革熱源性重組抗原DENVRA和正常細(xì)胞抗原（NCA）進(jìn)行溫育。溫育并洗板后，用HRP標(biāo)記的DEN特異性抗體處理。第二次溫育并洗板后，加入TMB底物液進(jìn)行溫育。之后再加入酸性終止液，450nm處測OD值可確定底物反應(yīng)的程度。當(dāng)高于一定數(shù)值時(shí)（臨界值），樣品的吸光度值可確定樣品中是否存在登革熱抗體。

注意：陰性質(zhì)控和弱陽性質(zhì)控以內(nèi)在質(zhì)控形式提供，其目的是為了監(jiān)測試劑盒成分的完整性。

試劑盒成分

登革熱IgM ELISA試劑盒提供了足夠做96個(gè)測試所需要的試劑。試劑盒成分如下：

登革熱檢測特定材料：

1）抗人IgM包被的包被板：帶板蓋的板架，包被有抗人IgM， 96孔，2-8℃下儲存，有效期內(nèi)穩(wěn)定。

2）樣品稀釋液：1瓶，25ml，即用，含吐溫20的Tris-HCl緩沖液，0.05%的Proclin防腐劑和添加劑，用于試驗(yàn)樣品，陽性和陰性質(zhì)控的稀釋，2-8℃下儲存，有效期內(nèi)穩(wěn)定

3）即用型的登革熱重組性抗原（DENRA）：1瓶，3ml，含吐溫20的Tris-HCl緩沖液，＜0.05%的Proclin防腐劑，抗生素（0.0025-0.004% G418 硫酸鹽），登革熱重組抗原和添加劑， 2-8℃下儲存，有效期內(nèi)穩(wěn)定。

4）即用型正常細(xì)胞抗原（NCA）：1支，3ml，含吐溫20的Tris-HCl緩沖液，＜0.05%的Proclin防腐劑，COS-1細(xì)胞的上清， 2-8℃下儲存，有效期內(nèi)穩(wěn)定。

5）登革熱陰性質(zhì)控：1支，50ul陰性血清，登革熱陰性質(zhì)控可輔助監(jiān)測試劑盒的完整性。2-8℃下儲存，有效期內(nèi)穩(wěn)定。

6）登革熱IgM陽性質(zhì)控：1支，50ul含0.03%的proclin的陽性血清，登革熱陽性質(zhì)控可輔助監(jiān)測試劑盒的完整性。2-8℃下儲存，有效期內(nèi)穩(wěn)定。

7）10倍濃縮洗滌液：1瓶，120ml，含吐溫20的10倍濃縮的磷酸緩沖鹽，2-8℃下儲存，有效期內(nèi)穩(wěn)定。

8）HRP標(biāo)記的即用型酶聯(lián)物，1瓶，6ml，HRP標(biāo)記的黃熱病毒活性單克隆抗體，含吐溫20的Tris-HCl緩沖液，＜0.01%的硫柳汞防腐劑和添加劑，2-8℃下儲存，有效期內(nèi)穩(wěn)定。

9）Enwash：1瓶，20ml，即用，含吐溫20的磷酸緩沖鹽， 2-8℃下儲存，有效期內(nèi)穩(wěn)定

10） TMB底物液：1瓶，9ml液態(tài)底物液，即用，2-8℃下儲存，有效期內(nèi)穩(wěn)定。注意：底物液必須始終儲存于避光試劑瓶中。

11）終止液：1瓶，內(nèi)含6ml即用型的終止液，1N的硫酸，2-8℃下儲存，有效期內(nèi)穩(wěn)定。注意：強(qiáng)酸，請戴保護(hù)手套、口罩和安全鏡，按照安全條例處理所有的材料。

實(shí)驗(yàn)所需器材但試劑盒不提供

1）可在450nm處讀數(shù)的酶標(biāo)儀

2）生物學(xué)或高純度水

3）真空泵

4）洗板機(jī)

5）37℃無CO2的孵箱

6）1-10ul的單道移液器，50-200ul的單道和多道移液器。

7）聚丙烯試管

8）Parafilm封口膜

9）計(jì)時(shí)器

10）旋渦混合器

樣品的采集與準(zhǔn)備

1）此實(shí)驗(yàn)必須用血清來做。全血和血漿樣本不能直接檢測。

2）不要將不同批次的試劑混亂

3）不要加熱熱滅活的試驗(yàn)血清

4）實(shí)驗(yàn)前將所有試劑平衡至室溫，溫度的改變會對試驗(yàn)有影響

5）避免反復(fù)凍融樣品血清

6）直接用干凈的槍頭從試劑瓶中移去試劑，不能轉(zhuǎn)移，避免污染

7）不用的板條應(yīng)立即放回至密封袋中保存

8）不要使用任何過期的試劑

9）避免試劑暴露受熱或陽光直射

10）有些試劑可能會產(chǎn)生沉淀，使用前一定要混勻

11）洗滌過程不完整會對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響

12）為了減少由于孵育時(shí)間的差異而引起的漂移，建議底物液和終止液加入的時(shí)間和速度要一致

13）避免試劑中有微生物污染，尤其是酶聯(lián)物

14）每一次吸取試劑，標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)控品時(shí)都應(yīng)用干凈的槍頭

實(shí)驗(yàn)步驟

將所有的試劑成分和樣品都平衡至室溫。實(shí)驗(yàn)前反復(fù)倒置以混合試劑和樣品。

試劑準(zhǔn)備：

1）1X洗滌液的配制：用生物學(xué)或高純度水將10倍濃縮型的洗滌液稀釋成1X的洗滌液。為了制備即用型的洗滌緩沖液，我們可以將120ml 10倍濃縮的洗滌液加入到1080ml蒸餾水或去離子水中，沖洗掉所有晶體，旋渦混合溶液以至所有晶體都溶解掉。制備好的洗滌液可在室溫下穩(wěn)定儲存6個(gè) 月。使用前請檢查洗滌液是否被污染。

2）包被板的準(zhǔn)備：將實(shí)驗(yàn)所需數(shù)目的板條置于板架上。將剩余的板條立即裝入包裝袋中，并儲存于2-8℃的環(huán)境下，有效期內(nèi)穩(wěn)定。
操作步驟：

1）陽性質(zhì)控、陰性質(zhì)控都必須做雙份檢測,DENRA和NCA都要檢測，未知血清樣品可做一份或雙份，DENRA和NCA都要檢測，按照說明書上的操作流程圖進(jìn)行操作。

2）將實(shí)驗(yàn)中使用的板條標(biāo)記好。

3）用試劑盒提供的樣品稀釋液將血清和質(zhì)控品稀釋100倍。用小聚丙烯試管進(jìn)行稀釋，稀釋時(shí)至少需要4ul血清、陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控。如：4ul血清加396ul稀釋液。

4）用單道或多道移液器將稀釋好的血清、陰性質(zhì)控和陽性質(zhì)控各50ul加入到相應(yīng)的微孔中。注意，所有的樣品都必須用DENRA和NCA檢測。

5）用封板膠僅在開放的微孔表面封板，所有板條的底部是沒有覆蓋的。

注意：這樣是為了保證溫度的分布在每個(gè)孔的底部和邊緣同等地散播。一旦頂部密封阻礙了蒸發(fā)，任何多余的封板膠必需被剪掉。

6）37℃下孵育1小時(shí)。注意：不要將微孔板疊放，必須單獨(dú)地分層平輔。這對于溫度的平等分布非常重要。不要使用CO2或任何氣體，不要讓板條接觸任何濕潤的物質(zhì)，如濕紙巾等。

7）溫育后，用洗板機(jī)洗板6次，每次每孔300ul。

8）在A-D列中加入50ul DENRA，在E-H列中加入50ul NCA。

9）用封板膠僅在開放的微孔表面封板，所有板條的底部是沒有覆蓋的。（同步驟5）

10） 37℃下孵育1小時(shí)。（同步驟6）

11）溫育后，用洗板機(jī)洗板6次，每次每孔300ul。

12）用多道移液器在每一微孔中加入50ul HRP標(biāo)記的酶聯(lián)物。

13）用封板膠僅在開放的微孔表面封板，所有板條的底部是沒有覆蓋的。（同步驟5）

14） 37℃下孵育1小時(shí)。（同步驟6）

15）溫育后，用洗板機(jī)洗板6次，每次每孔300ul。

16）用多道移液器在每一微孔中加入150ul Enwash溶液。

17）室溫下溫育（無需蓋板）5min。

18）溫育后，用洗板機(jī)洗板6次，每次每孔300ul。

19）用多道移液器在每一微孔中加入75ul TMB底物液。

20）室溫避光溫育10min。

21）溫育后，用多道移液器在每一微孔中加入50ul終止液，室溫溫育1min。

22）溫育后，450nm處測 OD值。

登革熱IgM ELISA實(shí)驗(yàn)操作流程圖：

羊抗人IgM包被的包被板

將1/100比例稀釋好的陰性質(zhì)控、陽性質(zhì)控和血清各50ul加入到相應(yīng)的微孔中

在每一微孔中加入50ul 即用型的DENRA和NCA

37℃下溫育1h，溫育后洗板6次,300ul/孔

在每一微孔中加入50ul HRP標(biāo)記的酶聯(lián)物

37℃下溫育1h，溫育后洗板6次

在每一微孔中加入75ul TMB底物液

室溫避光溫育10min

在每一微孔中加入50ul終止液

在每一微孔中加入150ul Enwash溶液，室溫溫育5min。之后用洗滌液洗板6次

酶標(biāo)儀450nm處讀取OD值

室溫溫育1min

質(zhì)量控制

每一試劑中均含有陰性和陽性質(zhì)控血清，這些質(zhì)控可接受的免疫指數(shù)（ISR）值會在以下的詳細(xì)表格中說明，陰性質(zhì)控和陽性質(zhì)控是用于監(jiān)測試劑的實(shí) 質(zhì)性錯誤，陽性質(zhì)控并不保證試劑臨界值的性。如果任一質(zhì)控的ISR值不符合說明書，則本次實(shí)驗(yàn)是無效的必須重做，如果實(shí)驗(yàn)是無效的，病人的結(jié)果不能公布。質(zhì)量控制的執(zhí)行必須與地方的，國家的或聯(lián)盟規(guī)則要求和你實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量控制程序標(biāo)準(zhǔn)相一致，建議使用者參照NCCLS C24A和42CFR493、1256作為質(zhì)量控制實(shí)踐的指引。以下的結(jié)果僅作為例子。

陰性質(zhì)控的計(jì)算：計(jì)算DENRA和NCA的登革熱病毒陰性質(zhì)控值。

例如：登革熱陰性質(zhì)控

DENRA NCA

0.108 0.066

No 2 0.082 0.061

總和 0.190 0.127

平均值（DENRA）= 0.190÷2 = 0.095

（NCA） = 0.127 ÷ 2 = 0.064

計(jì)算DENRA/NCA的比例： 0.095÷0.064 = 1.48

登革熱陰性質(zhì)控的計(jì)算DENRA/NCA比例高于1.65，則實(shí)驗(yàn)必須重做。

陽性質(zhì)控的計(jì)算：計(jì)算NCA和DENRA的登革熱IgM陽性質(zhì)控。

例如：登革熱陽性質(zhì)控

DENVRA NCA

0.635 0.105

No 2 0.655 0.115

總和 1.290 0.220

平均值（DENVRA）= 1.290÷2 = 0.645

（NCA） = 0.220 ÷ 2 = 0.110

計(jì)算DENVRA/NCA的比例： 0.645÷0.110 = 5.86

登革熱陰性質(zhì)控的計(jì)算DENVRA/NCA比例低于5.0，則實(shí)驗(yàn)必須重做。

為了能出具實(shí)驗(yàn)報(bào)告，實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須滿足下列表格的要求。如果實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能*下列要求，則說明試劑退化了或者實(shí)驗(yàn)步驟出現(xiàn)了問題，實(shí)驗(yàn)必須重做。

表1：

因素	可接受范圍
DENRA中登革熱陰性質(zhì)控的平均OD值	＜0.300
DENRA中登革熱陽性質(zhì)控的平均OD值	＞0.350
登革熱IgM陽性質(zhì)控的ISR	＞5.000
登革熱IgM陰性質(zhì)控的ISR	＜1.650

結(jié)果計(jì)算:

ISR值的計(jì)算：如果樣品是做雙份檢測，計(jì)算DENRA兩個(gè)陰性質(zhì)控的平均OD值，計(jì)算NCA兩個(gè)陰性質(zhì)控的平均OD值，并計(jì)算 DENVRA/NCA的比率（ISR）。如果未知樣品只做了一份，直接用DENVRA OD值除以NCA OD值

選擇臨界值和確定可疑范圍：109個(gè)真陽性和97個(gè)真陰性樣品用于優(yōu)化ISR臨界值，建立可疑范圍?？梢煞秶蓛蓚€(gè)臨界值決定，ISR≥2.84的為陽性，相應(yīng)的特異性為99%，靈敏度為91%；ISR≤1.65的為陰性，相應(yīng)的特異性為96%，靈敏度為94%，可疑范圍為1.65-2.84.

結(jié)果說明

表2：:

ISR	結(jié)果	說明
≤1.65	陰性	沒有可檢測到的IgM抗體，這結(jié)果不能排除登革熱感染。如果懷疑有早期感染，就應(yīng)該在7-14天內(nèi)對另外的樣品進(jìn)行檢測。其它登革熱測試方法也應(yīng)用來排除急性感染。
1.65-2.84	可疑	可疑樣品應(yīng)重復(fù)檢測。重復(fù)檢測后如果結(jié)果還是可疑，就應(yīng)用另外的方法來測試，或采集另一個(gè)樣品。
≥2.84	陽性	說明樣品中存在可檢測到的IgM抗體，建議做證實(shí)實(shí)驗(yàn)。

期望值

疫區(qū)人群

此登革熱IgM檢測試劑盒在2009年被南美的一間診所用于檢測有登革熱癥狀人群的血清樣本.被篩查的66位個(gè)體在起初都有發(fā)燒的癥狀.樣本中包含有初次和二次的感染.樣本的反應(yīng)關(guān)系見下面表3和表4.

表3：疫區(qū)人群患者的期望值

			檢測結(jié)果
年齡	男性人數(shù)	女性人數(shù)	無反應(yīng)人數(shù)	可疑人數(shù)	反應(yīng)人數(shù)	流行率
9-20	3	10	12	0	1	7.7%
21-30	5	7	8	1	3	25%
31-40	6	14	13	2	5	25%
41-50	7	6	9	2	2	15.4%
51-60	2	3	3	0	2	40%
61-70	2	0	2	0	0	0%
71-80	1	0	1	0	0	0%
總共	26	40	48	5	13	19.7%

a:所有反應(yīng)的樣品都經(jīng)PRNT驗(yàn)證

非疫區(qū)人群

2004年3月期間,從佛羅里達(dá)州, 德克薩斯州, 賓夕法尼亞州收集無登革熱癥狀的200份血清樣本.樣本覆蓋男女的不同年齡階段.被篩選的血清反應(yīng)性見下表4

表4：非疫區(qū)無登革熱癥狀人體的期望值

			檢測結(jié)果
年齡	男性人數(shù)	女性人數(shù)	無反應(yīng)人數(shù)	可疑人數(shù)	反應(yīng)人數(shù)	流行率
10-20	5	13	18	0	0	0.0%
21-30	38	30	68	0	0	0.0%
31-40	27	38	64	1	0	0.0%
41-50	23	20	42	0	1a	2.3%
51-60	5	1	6	0	0	0.0%
總共	98	102	198	1	1	0.5%

a:此樣品經(jīng)PRNT驗(yàn)證為登革熱陽性

性能特征

世界衛(wèi)生組織調(diào)研表

用于熱帶病和兒童登革熱研究和培訓(xùn)的詳細(xì)參考表由聯(lián)合國兒童緊急基金會/聯(lián)合國開發(fā)中心/世界銀行/世界衛(wèi)生組織共同提供的.由提供血清樣本的七間實(shí)驗(yàn)室共同出編制.

其中一張用登革熱IgM ELISA檢測試劑盒篩查實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表是在波多黎各的病控中心完成,具體見表5

表5：WHO參考樣品的反應(yīng)性

種類	檢測數(shù)	檢測結(jié)果	合計(jì)	種類	檢測數(shù)	檢測結(jié)果	合計(jì)
登革熱IgM陰性	27	陰性	27	系統(tǒng)性紅斑狼瘡	2	陰性	1
		可疑	0			可疑	1
		陽性	0			陽性	0
登革熱IgM陽性	109	陰性	4	萊姆IgG	9	陰性	9
		可疑	5			可疑	0
		陽性	100			陽性	0
西尼羅河病毒IgG	11	陰性	10	類風(fēng)濕因子	10	陰性	10
		可疑	1			可疑	0
		陽性	0			陽性	0
西尼羅河病毒 IgM	25	陰性	21	系統(tǒng)性紅斑狼瘡	2	陰性	2
		可疑	2			可疑	0
		陽性	2			陽性	0
黃熱IgM	4	陰性	3	漢坦病毒IgM	7	陰性	7
		可疑	1			可疑	0
		陽性	0			陽性	0

陽性率和陰性率制成表格形式，zui差的情況就是，可疑樣品對于陽性率來說是假陰性，而可疑樣品對于陰性率來說卻是假陽性。

陽性比率：（100/109） 91.7% （95% CI: 84.9-95.8%）

陰性比率：（90/97） 92.8% （95% CI: 85.6-96.7%）

臨床研究

研究中心1：

此研究采用了一系列具有登革熱癥狀的血清樣本.在規(guī)定的時(shí)期內(nèi)收集預(yù)定所需的樣本數(shù).197位個(gè)體的血清均取自東南亞的一些實(shí)驗(yàn)室,各取雙份（1至2周內(nèi)收集,共394份）經(jīng)實(shí)驗(yàn)室證明感染有登革熱的血清樣本.所有的個(gè)體在實(shí)驗(yàn)室經(jīng)不同的檢測方法（包括,PCR, IgG滴定等）確定為陽性結(jié)果.

以上所獲的樣本均用InBios公司提供的登革熱IgM ELISA試劑盒檢測.以發(fā)燒持續(xù)天數(shù)作為函數(shù)的陰性和陽性結(jié)果具體如下表.

表6：研究中心1的結(jié)果

發(fā)熱持續(xù)天數(shù)	陽性率	陰性率	可疑樣品但zui終診斷為陽性的數(shù)	可疑樣品但zui終診斷為陰性的數(shù)
2-3天	28.6%（2/7）	100.0%（4/4）	1	0
4-5天	40.3%（27/67）	78.8%（26/33）	19	7
6-7天	75.9%（63/83）	88.6%（31/35）	14	3
8-10天	88.8%（71/80）	97.1%（33/34）	7	1
11-15天	91.7%（22/24）	100.0%（21/21）	2	0
16-19天	100.0%（5/5）	100.0%（1/1）	0	0

注意：陽性率和陰性率制成表格形式，zui差的情況就是，可疑樣品對于陽性率來說是假陰性，而可疑樣品對于陰性率來說卻是假陽性。

研究中心2：

究所采集的具有登革熱癥狀的212個(gè)體樣本均來自美國西部.2008-2009年度在規(guī)定的時(shí)期收集到預(yù)定所需的樣本.其中大部分的樣品來自加勒比海和美國德克薩斯州和佛羅里達(dá)州.另外小部分的樣品來自非洲和亞洲.檢測的212份樣本中,116份為陰性,67份為陽性,29份為可疑樣本.可疑樣本按說明書的規(guī)定重測后,有13份為陰性,5份為陽性,11份仍為可疑樣本.

由于樣本量和樣本的獲取等各種原因,只有PRNT檢測了其中11份可疑樣本中的5份（其中3份為陽性）,72份陽性樣本中的70份（62份為陽性）. 另共有130份樣本不是用PRNT篩查,而是在疾控中心用CDC Dengue MAC ELISA檢測,共有9份不確定,4份可疑.再用PRNT重測,其中9份不確定樣本中有3份是陽性,4份可疑樣本中有2份為陽性. PRNT and CDC MAC ELISA具體統(tǒng)計(jì)見表7b.其中CDC MAC ELISA的13份可疑或不確定樣本由PRNT分類.

表7a：反應(yīng)樣品經(jīng)PRNT驗(yàn)證的結(jié)果

		zui終結(jié)果經(jīng)PRNT驗(yàn)證
		陽性樣品數(shù)	陰性樣品數(shù)	總共樣品數(shù)
檢測結(jié)果	陽性	62	8	70
	可疑	3	2	5
	陰性	4	3	7
	總共	69	13	82

表7b：反應(yīng)樣品經(jīng)CDC MAC Elisa ^a驗(yàn)證

		zui終結(jié)果經(jīng)CDC MAC Elisa^a驗(yàn)證
		陽性樣品數(shù)	陰性樣品數(shù)	總共樣品數(shù)
檢測結(jié)果	陽性	1	1	2
	可疑	1	5	6
	陰性	4	118	122
	總共	6	124	130

a: CDC MAC中的13個(gè)樣品仍為不確定或是可疑，zui終經(jīng)PRNT驗(yàn)證劃分

陽性和陰性率的計(jì)算由PRNT和CDC MAC數(shù)據(jù)共同決定

陽性率：（63/75） 84.0% （95% CI: 73.9-90.8%）

陰性率：（121/137） 88.3% （95% CI: 81.8-92.8%）

此比率是 PRNT和CDC MAC數(shù)據(jù)合并的結(jié)果，CDC MAC Elisa中的可疑或不確定的樣品（n=13）zui終經(jīng)PRNT劃分

研究中心3：

登革熱IgM Capture ELISA試劑盒特異性的評估在美國中西部的一間公共健康實(shí)驗(yàn)室完成.此項(xiàng)研究采用了289份有登革熱癥狀樣本（2005-2008年期間收集）（其中136位個(gè)體并發(fā)患有西尼羅河病毒, 甲型肝炎,乙型肝炎,HIV, 落磯山斑點(diǎn)熱（RMSF）, 軍團(tuán)病或萊姆病）.所有的檢測和診斷都在公共健康實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成.所有的樣本均采自沒有爆發(fā)過登革熱疫性的美國中西部.基于這種歷史條件,因此所有個(gè)體均可認(rèn)為無登革熱病毒攜帶者.

經(jīng)過*次的檢測和可疑樣本的重測,zui終得到215份樣本為陰性,22份仍為可疑.52份樣本為陽性.74份（包括陽性的和可疑）樣本均用PRNT重測過,發(fā)現(xiàn)zui終的交叉反應(yīng)的原因歸咎于西尼羅河病毒.

表8：美國無疫情的樣品檢測結(jié)果

		zui終診斷
		陰性，無其他疾病	陰性，伴隨其他疾病	PRNT陽性^a
檢測結(jié)果	陽性	1	40^b	11
	可疑	0	16^b	6
	陰性	100	115	0
	總共	101	171	17

a:所有登革熱PRNT檢測到的陽性樣品的滴定量較低，被認(rèn)定為是西尼羅河陽性血清，表明可能與登革熱PRNT發(fā)生了交叉反應(yīng)

b:注意：所有的假陽性和大量的可疑樣品僅僅是因?yàn)榕c西尼羅河陽性樣品間的交叉反應(yīng)

樣本可能會依據(jù)個(gè)人病情而進(jìn)一步細(xì)分，例如，西尼羅河病毒的陽性個(gè)體可能與登革熱試劑盒發(fā)生了交叉反應(yīng)，結(jié)果見下表

表9：上述疑似發(fā)生了交叉反應(yīng)的樣品檢測結(jié)果

		樣品狀態(tài)
		西尼羅河陰性，伴隨其他疾病	西尼羅河陽性
檢測結(jié)果	陽性	0	40
	可疑	0	16
	陰性	35	80
	總共	35	136

無其他疾病的陰性率：（100/101） 99.0% （95% CI: 94.1-100%）

除了西尼羅河病毒外地伴隨疾病的陰性率：（35/35） 100% （95% CI: 88.2-100%）

西尼羅河病毒的陰性率：（80/136） 58.8% （（95% CI: 50.4-66.7%）

35位個(gè)體未患有登革熱樣本（其中5份患有落磯山斑點(diǎn)熱（RMSF）,2份患有軍團(tuán)病,2份患有萊姆病,8份患有HIV,2份甲型肝炎,5份患有乙型肝炎,11份患有丙型肝炎）經(jīng)InBios 登革熱IgM

Capture ELISA檢測試劑盒檢測沒有一份表現(xiàn)為陽性或可疑.

在136位個(gè)體未患有登革熱樣本但攜帶有西尼羅河病毒的樣本中,80份為陰性,16份為可疑,40份為陽性.

研究中心4

登革熱IgM Capture ELISA試劑盒特異性的評估是在美國南部的一間健康中心進(jìn)行的.此次評估用了199份（從2004-2008期間收集）認(rèn)為無登革熱癥狀的樣本.大部分的病患有頭痛或發(fā)燒的癥狀,其他都表現(xiàn)出神經(jīng)系統(tǒng)方面的癥狀.初次檢測,183份樣本為陰性,10份為可疑,10可疑樣本經(jīng)重測后,其中有6份被檢測為陽性. 再重測一次,10份可疑樣本均為陰性.

這199份樣本進(jìn)一步用疾控中心用CDC Dengue IgM （MAC） ELISA檢測試劑盒重測,分類為陽性,陰性,可疑,不可解釋.zui終發(fā)現(xiàn)有16份樣本為無法解釋樣本. 這些可疑樣本用PRNT測則為陰性.如下表如示,用CDC Dengue IgM ELISA試劑盒檢測,總有1份樣本可疑,1份陽性.

表10：無疫情區(qū)的登革熱樣品檢測結(jié)果

		CDC登革熱IgM（MAC）elisa
		登革熱陽性樣品	登革熱可疑樣品	登革熱陰性樣品
檢測結(jié)果	陽性	0	0	6
	可疑	0	0	0
	陰性	1	1	191
	總共	1	1	197

陰性率：（191/197） 97.0% （95% CI: 93.4-98.7%）

研究中心5：

此次探究性研究采用55位具有癥狀表現(xiàn)的個(gè)體樣本（平均年齡在35.1年,樣本收集于2009年）均來自南美登革熱疫區(qū).樣本的2次訪問收集是在4-14天（平均9天）采集,樣本均用登革熱IgM Capture ELISA 檢測試劑盒檢測.可疑樣本用同樣的試劑盒重測.同時(shí)用PRNT方法驗(yàn)證第1次和第2次訪問的人群.在第1次和第2次之間訪問樣本的PRNT 4倍增長值表明有39位個(gè)體當(dāng)前具有登革熱癥狀.

表11：*次訪問采集的無疫情區(qū)的樣品檢測結(jié)果a

		zui終診斷
		近期感染樣品b	近期感染但無癥狀樣品c
檢測結(jié)果	陽性	13	0
	可疑	4	1
	陰性	22	15
	總共	39	16

a:陽性率：（13/39） 33.3% （95% CI: 20.6-49.1%）

陰性率：（15/16） 93.8% （95% CI: 69.7-100%）

b:PRNT陽性且*次和第二次收集的樣品之間增加值大于4倍

c:PRNT陽性且*次和第二次之間增加值小于4倍

第二次訪問個(gè)體（4-14天）的血清樣本的結(jié)果如下表所示,檢測的靈敏度隨第二次訪問的時(shí)間間隔而增加.

表12：第二次訪問采集的無疫情區(qū)的樣品檢測結(jié)果

		zui終診斷
		近期感染樣品b	近期感染但無癥狀樣品c
檢測結(jié)果	陽性	31	1
	可疑	2	0
	陰性	6	15
	總共	39	16

a:陽性率：（31/39） 79.5% （95% CI: 64.2-89.5%）

陰性率：（15/16） 93.8% （95% CI: 69.7-100%）

b:PRNT陽性且*次和第二次之間增加值大于4倍

c:PRNT陽性且*次和第二次之間增加值小于4倍

如“結(jié)果解釋”部分提到的，可疑樣品應(yīng)進(jìn)行重復(fù)檢測，如果還是可疑樣品則需送去認(rèn)證測試

回收率研究

五天內(nèi)在不同的三個(gè)地點(diǎn),兩個(gè)不同的操作者完成對登革熱 IgM Capture ELISA檢測試劑盒可重現(xiàn)性研究實(shí)驗(yàn)的評估.樣本（包括質(zhì)控）均同時(shí)采用三份檢測.實(shí)驗(yàn)分別在佛羅里達(dá)州一間公共健康實(shí)驗(yàn)室, InBios,美國中部的一家實(shí)驗(yàn)室.此次研究實(shí)驗(yàn)采用4份血清樣本（均按照相關(guān)規(guī)定稀釋）.包括一份陰性樣本,一份剛低于可疑范圍的樣本,一份可疑樣本,一份陽性樣本.血清樣本的稀釋均符合臨床相關(guān)要求檢測的濃度范圍.具體結(jié)果見下表.

表13：inbiosa公司登革熱試劑盒的再現(xiàn)性

			板間試驗(yàn)		不同的時(shí)間		不同的操作者		不同的地點(diǎn)		合計(jì)
樣品	N	ISR平均值	Swr	%CVwr	S_OD	%CV_OD	S_OO	%CV_OO	Sss	%CVss	S_T	%CV_T
板A	90	1.133	0.148	13.06	0.056	4.96	0.066	5.86	0.064	5.63	0.158	13.97
板B	90	1.587	0.245	15.41	0.187	11.79	0.182	11.44	0.081	5.11	0.308	19.40
板C	90	2.433	0.621	25.52	0.668	27.46	0.522	21.44	0.207	8.52	0.912	37.49
板D	90	5.821	1.18	20.28	2.014	34.59	1.072	18.41	0.693	11.91	2.334	40.10
陽性質(zhì)控	90	11.944	1.692	14.17	2.437	20.40	2.085	17.46	1.546	12.94	2.967	24.84
陰性質(zhì)控	90	1.148	0.152	13.25	0.088	7.67	0.064	5.61	0.051	4.47	0.176	15.31

所有值都用DENRA/NCA比值計(jì)算

Sx=標(biāo)準(zhǔn)劃分，如wr是板間試驗(yàn)，DD不同天地試驗(yàn)，OO不同操作者的試驗(yàn)，SS不同地點(diǎn)的試驗(yàn)

CV=變異系數(shù)

交叉反應(yīng)研究

用登革熱 IgM Capture ELISA檢測試劑盒檢測帶有幾種疾?。ㄒ娤卤恚┑难鍢颖?樣本均采用雙份檢測.檢測得到陽性和可疑性的樣本采用一式三份重測.用血小板減少中和反應(yīng)檢測陽性樣本是為了評估登革熱病毒的可暴露性.明顯的交叉反應(yīng)只在西尼羅河病毒中觀察到。

表14：交叉反應(yīng)

疾病或致病原	樣品數(shù)	DENV Detect IgM ELISA		可疑和陽性樣品合計(jì)	陽性或可疑率

		可疑	陽性
東部馬腦炎a	10	0	0	0/10	0%
乙腦a	2	0	0	0/2	0%
圣路易型腦炎a	4	0	0	0/4	0%
乙型肝炎a	10	0	0	0/10	0%
EB病毒a	15	0	0	0/15	0%
類風(fēng)濕因子a	7	0	0	0/7	0%
丙型肝炎a	10	0	0	0/10	0%
巨型細(xì)胞病毒a	10	0	0	0/10	0%
核抗體a	10	0	0	0/10	0%
水痘帶狀皰狀病毒a	10	0	0	0/10	0%
萊姆病a	5	0	0	0/5	0%
鉤端螺旋體a,b	11	0	0	0/11	0%
西尼羅河a	24	4	8	12/24	50%
合計(jì)	112	4	8	12/128	9.4%

a:篩查其他含有特異性 IgM抗體的樣品，與瘧疾IgM抗體的交叉反應(yīng)不能用inbios的登革熱檢測試劑盒評估

b:PRNT試驗(yàn)中，鉤端螺旋體樣品與登革熱酶免試驗(yàn)發(fā)生反應(yīng)，呈陽性（表格中不包括此結(jié)果，因?yàn)樗皇钦骊栃詷悠罚?/div>

除掉三份血清樣品（一份西尼羅河陽性，一份乙腦陽性和一份鉤端螺旋體陽性）的其他128份樣品經(jīng)PRNT驗(yàn)證后為陽性，24份篩查出的陽性或可疑樣品經(jīng)登革熱ELISA重測后，有12份西尼羅河陽性樣品，與西尼羅河的交叉反應(yīng)率為50%。

干擾研究：

四種干擾物質(zhì)對登革熱酶免試驗(yàn)的影響。一份登革熱陰性和四份登革熱陽性樣品根據(jù)弱陽性到強(qiáng)陽性依次排列。四種干擾物質(zhì)為膽紅素，甘油三酯，血紅蛋白，膽固醇。膽紅素不會對試驗(yàn)產(chǎn)生影響，高濃度的甘油三酯對弱陽性血清有輕微影響，增大ISR值，血紅蛋白的高濃度和低濃度都會降低ISR值，膽固醇的重復(fù)研究可得出多個(gè)結(jié)果，結(jié)果顯示膽固醇的兩個(gè)濃度都會影響DENRA的OD值，下表是相對于參考樣品，加入干擾物質(zhì)后ISR值的改變率

表15：加入干擾底物后ISR值的改變率

	質(zhì)控 ISR值	膽紅素		甘油三酯		血紅蛋白		膽固醇
		1mg/dL	2mg/dL	500 mg/dL	3000 mg/dL	1600 mg/dL	16000 mg/dL	300 mg/dL	500 mg/dL
陽性質(zhì)控	20.84	16.4%	-1.0%	-1.7%	9.8%	-67.2%	-80.6%	21.8%	-1.9%
陰性質(zhì)控	1.18	-1.0%	-4.8%	-0.4%	7.2%	-1.3%	3.7%	7.0%	29.4%
樣品D	14.40	-0.9%	-2.6%	20.8%	31.6%	-43.5%	-62.6%	-10.8%	-17.3%
樣品E	6.36	25.1%	8.4%	-19.4%	-28.6%	-59.8%	-69.6%	-49.5%	-5.1%
樣品F	0.94	15.5%	0.1%	-7.5%	-12.9%	-0.1%	12.2%	4.0%	1.1%